回到延安后，周恩来参加中央关于红军改编出动抗日的会议，决定：立即争取西安行营的同意，将红军集中三原改编，编足4万5千人，3个师以上设总指挥部（将来可让步为军部），朱德任正职，彭德怀任副职。
7月29、30日，北平、天津相继沦陷，蒋介石终于发表《告抗战全军将士书》，声称：“和平既然绝望，只有抗战到底。”
形势急转直下，民族危亡迫在眉睫，红军改编已是刻不容缓。
周恩来和博古立即赶赴云阳镇，出席红军前敌总指挥部召开的红军高级干部会议，共议红军改编、出动抗日的问题，并同朱德、彭德怀、任弼时等商定红军改编中的编制、分布、干部配备等问题。
就在此时，叶剑英从西安拍来电报，告诉周恩来，桂系将领李宗仁、白崇禧，川军将领刘湘将去南京，出席国民政府军事委员会召开的国防会议。
蒋介石、李宗仁这对生死冤家都能坐在一起，共议危亡之局，真可谓“兄弟阋于墙，外御其侮。”
周恩来料想中共也将被邀参加会议，为了掌握团结抗日的主动权，他致电毛泽东、张闻天，提出中共应派人参加，争取公开合法的地位。
果然，8月1日，毛主席转来张冲的急电：蒋介石密邀毛泽东、朱德、周恩来速至南京共商国防问题。
停顿下来的国共谈判又峰回路转，柳暗花明。
周恩来电复张冲：如开国防会议，则同朱德、叶剑英去；如系谈话会，则同林伯渠、博古、叶剑英去。
张冲立即复电，告诉是开国防会，望毛泽东、朱德、周恩来到南京参加会议。
南京方面连日电文，其急迫的心情已是不言而喻。
在南京举行的第五次谈判，红军改编和出动抗日将是最突出的问题，周恩来对此做了认真的准备。
8月4日，他和朱德、博古、林伯渠、彭德怀、任弼时认真研究和讨论后，向中央提出了《关于全国对日抗战及红军参战问题的意见》和《关于红军主力出去抗战的意见》。
第二天，周恩来便收到毛主席、张闻天的复电，其中指出，红军担负的是“独立自主的游击运动战，钳制敌人大部分，消灭敌人一部”。“在一定地区内协助正面友军作战”。遵循“按情况使用兵力的原则，在此原则下，承认开拔兵力”。
周恩来和朱德等来到西安后，得知红军西路军的1000多名被俘人员关押在西安，便立即派孔石泉前往了解情况。
在确认情况属实后，他立即前往西安行营，直接同蒋鼎文交涉，要求予以释放。
当天，便有30名西路军干部获释，接着又有210余人获释。
这是一个良好的开端，周恩来满怀希望和信心。
9日，周恩来同朱德、叶剑英飞抵南京。
在南京期间，他们活动频繁，多次与冯玉祥、白崇禧、刘湘和龙云等会晤，处于秘密状态的共产党，在经历十年风雨后，终于得以公开活动。
在国民政府军政谈话会上，周恩来再次阐明中共中央关于对日抗战的方针意见。
他指出，当前战争中，必须培养出可以独立持久的能力。
在正面防御上，不可以停顿于一线及数线的阵地，而应当由阵地战转为平原与山地的扩大运动战。
另一方面，则要采取游击战。
朱德也做了发言。
他们的意见，获得与会者的好评，对于国民政府制定全国抗战的战略方针，产生了积极的影响。
可是，在讨论国共合作的具体问题上，蒋介石仍然挑刺，提出种种非议，为7月间就交予的《中共中央为公布国共合作宣言》，他一直不予发布。
当周恩来重提此事时，他让康泽出面对周恩来说，中共的宣言不宜提“民主”，应一律改为“民用”；要取消对民族、民权、民生的解释；不同意提同国民党获得谅解而共赴国难等。
就在康泽与周恩来会谈的第二天，日军突然发动对上海的大规模进攻。
上海军民奋起抵抗，“八一三”淞沪抗战爆发，战火逐步向国民政府所在地南京蔓延。
蒋介石措手不及，心中的那点侥幸，彻底破灭，下决心与日本决战。
周恩来紧紧把握时机，立即向中共中央请示，在将要进行的谈判中，我们应努力达到：
（一）努力抗战，以巩固蒋介石的抗战决心；（二）红军立即改编，争取开动；（三）力争发表《中共中央为公布国共合作宣言》；（四）催促发表正副总指挥。
大敌当前，蒋介石不得不同意中共中央的条件，国共谈判中久拖不决的问题，终于得到落实。
18日，蒋介石同意红军改编为国民革命军第八路军，任命朱德、彭德怀为正副总指挥，并于22日正式发表文告。
红军改编后的指挥机关和人事任命问题，总算得以解决。
9月22日，国民党中央通讯社正式播发《中共中央为公布国共合作宣言》。
根据中共中央书记处的指示，周恩来多次与国民党谈判，强调八路军可以充任战略的游击支队，在总的战略方针下，进行独立自主的游击战争。
蒋介石、何应钦同意八路军充任战略游击支队，执行侧面战，协助友军，扰乱与钳制日军大部并消灭一部分的作战任务。
八路军的战略任务确定后，周恩来和叶剑英立即致电毛泽东等，部队仍以迅速开拔为有利，提议：“至少应以一个旅为先遣部队，先行东进。”
毛泽东当日复电彭德怀、任弼时：“同意恩来提议”。红一军团为先遣部队，即日出动。
自8月下旬起，八路军3个师的主力陆续由韩城等处东渡黄河，经同蒲铁路开赴抗日前线。
红军主力的改编刚一落实，周恩来便考虑与蒋介石讨论南方红军游击队的改编和中共合法机构的问题。
何应钦代表蒋介石同周恩来具体商谈，他同意中共派人到南方各游击区，传达中共中央指示，并协助红军游击队改编为国民革命军新编第四军。
通过这次与蒋介石等的谈判，国民党允许在南京、上海等地设立中共代表团和八路军办事处。
后来，又在武汉、长沙、兰州等地设立中共代表团办事处、八路军办事处、新四军通讯处等。
谈判中，周恩来强烈要求国民党释放被关押的共产党员。
8月18日，他和叶剑英到“首都反省院”，看望被捕的中共党员。
经过反复交涉，当天，夏之栩、熊天荆、王根英获释。
随后，陶铸、钱瑛、刘宁一、帅孟奇、张琴秋等也都获释。
还是在庐山谈判时，周恩来便提出中共在南京公开出版发行《新华日报》。
当再次磋商此事时，很快便收到国民党中央宣传部长邵力子的批文。
周恩来十分高兴，立即和朱德前往拜望国民党元老、监察院院长于右任，请他为《新华日报》题写报名，于右任欣然应允。
南京谈判历时十余天，一些根本问题都得到解决，第二次国共合作的局面正式形成。
8月21日，周恩来要参加将在洛川召开的中央政治局扩大会议，离开南京前往西安，谈判中的未竟事宜，交由叶剑英等继续谈判和交涉。